關鍵詞：Phase Ⅰ Metabolism，Metabolic Stability，CytochromeP450，CYP450，Liver microsomes，Primary hepatocytes

藥物代謝又稱生物轉化(biotransformation)，是指藥物被機體吸收后，在體內各種酶以及體液環境作用下發生化學結構的改變的過程。藥物在體內的生物轉化可分為Ⅰ相代謝反應（Phase Ⅰ Metabolism）和Ⅱ相代謝反應（Phase Ⅱ Metabolism），兩種類型的反應都得到極性更強、水溶性更好的產物，因此它們更易通過膽汁和尿被排泄出體外。代謝穩定性（Metabolic Stability）反映了化合物對生物轉化的敏感性，它會影響化合物的口服生物利用度以及體內半衰期，進而影響到化合物在體內的安全性和有效性。因此，在藥物研發初期，有必要對藥物的代謝穩定性情況進行考察。與體內代謝穩定性研究相比，藥物體外代謝穩定性研究可排除體內諸多干擾因素的影響，有助于更直接地觀察藥物的代謝特征，具有省時、穩定、高效的特點，可用于候選藥物的高通量篩選。本文簡要介紹藥物體外Ⅰ相代謝穩定性體外研究方法及數據分析，以供參考。

一、藥物Ⅰ相代謝介紹

藥物Ⅰ相代謝（Phase Ⅰ Metabolism）是指藥物分子上引入新的基團或除去原有小基團的官能團反應，包括氧化、還原和水解等反應。Ⅰ相代謝反應中最重要的酶系是細胞色素P450（CytochromeP450，CYP450），屬于單加氧酶（momooxygenase），主要存在于滑面內質網的微粒體中，能催化烷烴、烯烴、芳烴和類固醇等多種物質進行氧化反應。該酶系由細胞色素P450和NADPH-細胞色素P450還原酶（以FAD為輔基的黃素蛋白）偶合組成，需要分子氧和還原輔酶Ⅱ（NADPH）參與反應，催化基本反應為：

單加氧酶能直接激活氧分子，使其中一個氧原子直接加入底物分子中形成羥化物或環氧化物，另一個氧原子則被NADPH還原為水。由于一個氧分子發揮了兩種功能，故單加氧酶系又稱為混合功能氧化酶；又因底物的氧化產物是羥化物，所以又稱為羥化酶。單加氧酶的反應過程見圖1：

圖1 單加氧酶的反應過程

此外，參與Ⅰ相代謝過程還原反應的酶主要有硝基還原酶和偶氮還原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物還原生成胺類；參與水解反應的酶包括酯酶、酰胺酶、糖苷酶等，可分別催化酯類、酰胺類、糖苷類化合物的水解以降低或消除其生物活性。

由此可見，Ⅰ相代謝是藥物代謝的重要環節，通過Ⅰ相代謝反應，藥物分子的化學結構會發生變化，例如引入或暴露某些官能團（如羥基、氨基等）。這些結構改變會使藥物的性質產生變化，影響其藥理活性、毒性以及藥代動力學特征等。它在藥物研發、藥物療效和安全性評估等方面都有著關鍵意義，如果藥物的Ⅰ相代謝穩定性較差，可能導致在體內過快或過慢地代謝，從而影響藥物的有效性和安全性。因此，了解待測化合物的Ⅰ相代謝穩定性對于選擇具有良好藥代動力學特征的候選藥物至關重要。

二、藥物Ⅰ相代謝穩定性體外研究方法

由于肝臟是藥物代謝的重要器官，是機體進行生物轉化的主要場所，富含參與藥物Ⅰ相代謝反應的各種酶，因此，藥物體外代謝穩定性研究多以肝臟為模型。較常使用的肝臟體外代謝模型有肝微粒體（Liver microsomes）和原代肝細胞（Primary hepatocytes）等。

（1）肝微粒體體外溫孵法試驗方法     

肝微粒體中包含了大部分Ⅰ相代謝酶，其中最重要的是以CYP450為主要成分的微粒體混合功能氧化酶系統，在用肝微粒體進行研究時，如加入相應的輔助因子NADPH，則可重組體外代謝體系，從而通過體外溫孵法進行Ⅰ相代謝穩定性研究。

① 樣本準備：肝微粒體（人、猴、犬、大鼠、小鼠等種屬），試驗體系中微粒體蛋白終濃度建議是在0.1mg/mL-1mg/mL之間；待測藥物終濃度一般為1μM，不建議過高。

② 溫孵反應：將肝微粒體、測試藥物溶液以及NADPH再生系統混合于合適的反應容器（如小型離心管）中。通常反應體系的體積在200-500μL左右。將反應容器置于37°C環境中孵育一定時間，如0，5，10，15，30，60 min。每個樣品平行3次，同時需設置空白對照組、陰性對照組和陽性對照組。

③ 終止反應與樣本處理：孵育結束后，可通過加入有機溶劑（如乙腈等）進行終止反應。然后通過離心等手段進行樣本處理，離心條件如13000-15000 rpm離心5-10分鐘，然后取上清液進行檢測。

④ 檢測分析：使用HPLC、LC-MS/MS等分析技術檢測樣本中的藥物原形剩余量及其代謝產物，進而分析藥物的半衰期及固有清除率，以此評估其在Ⅰ相代謝中的穩定性。圖2為采用LC-MS/MS測定某種藥物在人、犬和大鼠肝微粒體中的代謝情況，從圖上可知，該藥物在三種肝微粒體中均存在明顯代謝，但不同種屬間又存在顯著差異。

圖2某種藥物在人、犬、大鼠肝微粒體中的代謝情況

（2）原代肝細胞體外溫孵法試驗方法

原代肝細胞保持了完整的細胞結構，擁有更完整的代謝酶系統和不同清除途徑的輔酶因子。可采用原代肝細胞體外溫孵法進行藥物代謝穩定性試驗。

① 原代肝細胞獲取與準備：可以從新鮮肝臟組織通過機械和酶消化等方法獲取原代肝細胞（人、猴、犬、大鼠及小鼠等種屬）。分離得到的肝細胞要進行細胞活力檢測，只有活力較高（一般要求在80%以上）的細胞才適合用于后續試驗。反應體系中原代肝細胞的濃度可在0.5-2×106/mL之間調整。

② 溫孵反應：將原代肝細胞和測試藥物（建議終濃度為1μM）于適合的條件（如37℃、5% CO?）下進行孵育一定時間，如0、15、30、60、90、120min。

③ 終止反應與樣本處理：孵育結束后，可通過加入有機溶劑（如乙腈等）進行終止反應。樣本離心后取上清液進行檢測。

④ 檢測分析：使用HPLC、LC-MS/MS等分析技術檢測樣本中的藥物原形剩余量及其代謝產物，進而分析藥物的半衰期及固有清除率，以此評估其在Ⅰ相代謝中的穩定性。

由此可見，肝微粒體和原代肝細胞都可通過體外溫孵法進行藥物Ⅰ相代謝穩定性研究。兩者的區別如下所示，客戶可根據實際情況進行選擇。

【肝微粒體使用場景及選擇】

√ 化合物分子水溶性較強，強烈推薦選擇肝微粒體。

√Ⅰ相代謝為主要代謝途徑(尤其是經由CYP450酶代謝)等情況下，強烈推薦選擇肝微粒體。

√ 肝微粒體成本相對較低、易于儲存和使用，操作簡便，適用于大量化合物的初步篩選、評估化合物代謝穩定性、指導結構修飾等研究。

√ 肝微粒體缺乏完整的細胞結構，無法模擬藥物的攝取、轉運等過程，試驗結果可能與體內實際情況存在一定差異，需要結合其他試驗方法進行綜合評估。

【原代肝細胞適用場景及選擇】

√ 肝微粒體中非特異性蛋白結合較高時，可選擇原代肝細胞。

√ 肝微粒體體中代謝不明顯時，可嘗試使用原代肝細胞。

√ 化合物主要經由醛氧化酶（AO）或者單胺氧化酶（MAO）等非CYP450氧化酶代謝或者水解反應為主要代謝途徑時，可選擇原代肝細胞。

√ Ⅱ相代謝為主要途徑時，選擇原代肝細胞。

√ 原代肝細胞具有完整的細胞膜結構和各類藥物轉運體，更適用于需要模擬真實體內代謝環境、評估藥物口服生物利用度、預測人體清除率等研究。但原代肝細胞試驗成本較高，操作相對復雜，對實驗條件要求較高。

三、IPHASE 體外Ⅰ相代謝穩定性試驗數據分析

1.代謝正常

一般情況下，體外代謝穩定性試驗的要求是：如果藥物發生了代謝，則R2>0.9；3個平行數據間的CV%需在15%之內，允許有一個時間點超限；如果有2個時間點超限可依據情況舍點取平均值；如果底物剩余<5%，則CV%值沒有限制。如上表所示，該次試驗符合體外代謝穩定性的試驗要求，是正常代謝的情況。可以看出，該藥物在肝微粒體中的半衰期是5.54min，體外固有清除率為250μL/mg/min。

2. 藥物在肝微粒體中不代謝

某次在進行肝微粒體藥物Ⅰ相代謝穩定性結果統計后發現，隨著時間的延長，藥物的剩余量基本沒有變化，可認為該藥物在肝微粒體中沒有發生代謝。排除產品本身質量問題后，可能的原因有：（1）藥物通過非CYP450酶代謝，而該酶在肝微粒體含量很低，活性較弱；（2）該藥物主要代謝途徑是Ⅱ相代謝，可嘗試進行Ⅱ相代謝穩定性試驗觀察結果；（3）該藥物為慢代謝藥物，不適合用肝微粒體代謝模型進行試驗。因此，針對Ⅱ相代謝的藥物，客戶可以嘗試使用微粒體進行Ⅱ相代謝穩定性測試，也可以更換為原代肝細胞或者肝S9等體外代謝模型。針對肝微粒體中該藥物代謝酶活性低的情況，則需要選擇原代肝細胞或者肝S9等模型進行測試。而針對慢代謝藥物，常規的微粒體和肝細胞代謝模型無法滿足試驗要求，可以選擇肝細胞共培養系統進行試驗。

3. 酶活問題

如上表所示，在進行肝微粒體Ⅰ相代謝穩定性試驗時發現，藥物在10min后的代謝情況不明顯，代謝趨于平緩，從而在進行數據擬合時線性關系不佳（R2=0.7359＜0.9）。出現該情況可能的原因有：（1）酶活問題。代謝該藥物的酶在肝微粒體中的含量較低，活性較弱，因此在10min后，藥物的代謝趨于平緩，呈現出基本不代謝的情況。此時可嘗試適當提高體系中微粒體蛋白的濃度再嘗試一下（建議體系中的蛋白濃度≤1mg/mL，蛋白濃度過高會和藥物發生非特異性結合）。（2）產品問題或者批間差異。產品本身質量問題或者批次間的差異所致，可更換不同批次的肝微粒體產品進行試驗。因此，發生該情況后可進行重復驗證，以找到出現該問題的原因。

4. 檢測方法或者處理溶劑問題

在實際操作中，可能會遇到這樣一種情況：隨著孵育時間的延長，在某個時間點后，底物的剩余量反而增多，如圖上表中的數據一樣，在第10min時，底物剩余量為97%，第15min時，底物剩余量增至105%，之后達到了123%，針對這一“反常"情況，我們分析可能的原因有：（1）檢測方法問題。檢測方法不合適，底物中包含了代謝產物的峰，導致峰面積變大，此時需要優化檢測方法。（2）處理溶劑問題。在終止反應時所用的有機溶劑不合適，可嘗試更換終止液（如由乙腈更換為甲醇等）。

綜上所述，代謝穩定性是影響化合物暴露量和生物利用度的主要因素之一，在藥物的有效性和安全性方面發揮著至關重要的作用。因此，在藥物研發初期，進行體外代謝穩定性試驗對于預測人體內清除率、篩選優勢化合物及構建IVIVE模型等方面具有重要意義。

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